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下游實驗

細胞實驗

敲除細胞株構建

技術原理:

        Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic RepeatsCRISPR/Cas9是細菌和古細菌在長期進化而形成的一種適應性免疫防御機制,CRISPR/Cas9系統可以用于各種基因組的編輯。CRISPR/Cas9系統會通過小導向RNA(sgRNA)對切割區域進行識別,并利用Cas9內切酶實現在識別位點中間預測的位置切割,造成DNA雙鏈斷裂,在細胞進行易錯修復后造成隨機的突變。CRISPR/Cas9系統其突變效率高、靈活簡單,周期短,成本低,已經被廣泛的應用于基因編輯的研究。CRISPR/Cas9系統應用最多的領域是基因敲除株系構建和基因敲除動物的研究。

                                                                    CRISPR/Cas基因組編輯原理

        可提供項目服務包括:CRISPR/Cas9實驗方案設計、CRISPR/Cas9基因敲除載體構建、CRISPR/Cas9基因敲除載體病毒包裝、CRISPR/Cas9基因敲除細胞株構建

服務特點:

1.定制特定基因敲除細胞系只需提供基因名稱;

2.快速獲得有效sgRNA,基因編輯效率高;

3.實驗周期短;

4.可根據需要提供CRISPR/Cas9慢病毒包裝服務。

操作流程:

1.靶向目的序列sgRNA的設計、載體構建及活性驗證;

2.目的細胞系共轉染,初步篩選混合克隆;

3.鋪單克隆,單克隆篩選及鑒定細胞基因型;

4.陽性細胞株的擴增。



 

雙螢光素酶檢測

螢光素酶是理想的報告基因,因為哺乳動物細胞中不含內源性螢光素酶,一旦轉錄完成立刻就生成功能性的螢光素酶。單報告基因實驗往往會受到各種實驗條件的影響,而雙報告基因則通過共轉染的對照作為內參為試驗提供一基準線,從而可以在最大程度上減小細胞活性和轉染效率等外在因素對實驗的影響,使得數據結果更為可信。Dual-Luciferase®雙螢光素酶報告基因檢測系統在細胞中同時表達螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶,兩者沒有種源同源性并對應不同的反應底物,故而沒有交叉干擾。得益于超強的光信號和超高的信噪比。

miRNA靶基因驗證


miRNA主要通過作用于靶基因的3’UTR起作用(降解或抑制翻譯),將目的基因3’UTR(野生型和結合位點突變型)序列構建至載體中報告基因F-Luc3’端,通過比較過表達miRNA后,報告基因表達的改變(螢光素酶的活性下降還是不變),來確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點。

目的:驗證 miRNA與靶基因3’UTR 是否發生調控作用。

:質粒pMIR-REPORT Luciferase基因3'UTRWt);pMIR-REPORT Luciferase-基因3'UTRMut);pRL-CMVH321Promega);293T細胞株

步驟:靶點預測——構建質粒——轉染細胞檢測——報告基因檢測(Luciferase活性檢測)——統計分析

結果

 


啟動子活性研究

轉錄因子是一種具有特殊結構、行使調控基因表達功能的蛋白質分子,也稱為反式作用因子。某些轉錄因子僅與其靶啟動子中的特異序列結合,這些特異性的序列被稱為順式因子,轉錄因子的DNA結合域和順式因子實現共價結合,從而對基因的表達起抑制或增強的作用。

轉錄因子主要通過作用于靶基因的啟動子起作用,將目的基因啟動子區序列替換報告基因F-Luc的啟動子,通過共表達轉錄因子后,報告基因表達的改變,來確定轉錄因子與靶基因啟動子結合位點及對靶基因的作用。

目的:檢測轉錄因子對目的基因啟動子活性的影響

材料:實驗質粒(pGL4.10-基因promotor);對照質粒; pRL-CMVE2261Promega);轉錄因子質粒;293T細胞株

步驟:靶點預測——構建質粒——轉染細胞檢測——報告基因檢測(Luciferase活性檢測)——統計分析

結果

 

客戶需提供信息:

1.靶基因名稱

2.靶基因種屬

3.調控因子(miRNA或者轉錄因子)名稱

提供給客戶:

1.結合位點預測結果

2.質粒及其構建報告

3.雙熒光素酶檢測報告



定細胞株構建


        外源基因在細胞中的表達可分為兩大類,一類是瞬時表達,外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中,雖然可以達到高水平的表達,但通常只持續幾天;一類是穩定表達(構建穩轉株),外源DNA整合到宿主細胞染色體上,使宿主細胞可長期表達目的基因。

        建立穩定細胞株,基本原理是將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上,載體被轉染到宿主細胞并整合到宿主染色體中,用載體中所含的抗性標志進行篩選。最常用的真核表達載體的抗性篩選標志物有新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)和嘌呤霉素(puromycin),篩選得到可穩定表達目的蛋白、或穩定沉默特定基因的細胞株。

篩選方法:

慢病毒感染篩選穩定細胞株

        利用慢病毒整合表達特性來篩選穩定細胞株,該方法克服了傳統質粒挑單克隆方法周期久的弊端,可以在短時間內高效獲取穩定細胞株。

利用慢病毒制備穩定株優勢:

1)細胞適用種類廣泛,可用于各種哺乳動物細胞;

2)構建穩轉株時間短,表達持續時間長;

3)多種熒光標記和抗性基因可選,滿足觀測實驗要求。



 穩定細胞株分類:

混合克隆穩定細胞株

        混合克隆細胞系是基因轉染后直接用抗藥篩選得到的,篩選出的細胞都表達抗性基因和目的基因,但包含了各種不同的細胞克隆。不同克隆的目的基因整合位置和表達量均有所不同。

        混合克隆細胞株篩選比較快速,費用較低。在需要構建的細胞株轉染效率高,目的基因表達效率高的情況下,單克隆細胞株最后得到的表達效果和混合克隆細胞株并沒有顯著差異,這時多克隆細胞篩選是理想的選擇。

單克隆穩定細胞株

        單克隆細胞系是由含有穩定整合外源片段的單個細胞的擴增得到的細胞株,每個細胞的目的基因整合位置的表達量均高度一致,但可能丟失一些表型。單克隆細胞株篩選周期長,費用高。需要進行細胞亞定位實驗的細胞系,難感染的和表達率低的通常建議進行單克隆細胞篩選。

服務流程


已構建的穩定株列表(部分):


 


細胞功能學實驗

1.細胞增殖

        細胞增殖與細胞凋亡、細胞周期等是腫瘤研究的重要表型,是分子生物學和藥理學研究解決的問題之一。通過在細胞中過表達或干擾某個基因研究基因對細胞增殖能力的影響,進一步研究基因的功能,或對細胞進行藥物處理,研究藥物對增殖的影響。

實驗原理(CCK-8)

    細胞增殖是生物體的重要生命特征,細胞以分裂的方式進行增殖,是生物體生長、發育、繁殖和遺傳的基礎。細胞增殖的研究方法有很多,主要包括:CCK8/ CellTiter-Glo?等方法。

    Cell Counting Kit-8(簡稱CCK-8)試劑可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為:該試劑中含有WST-8【化學名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】,它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物(Formazan dye)。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。

CCK-8方法優勢:

(1)操作簡單,避免細胞計數過程中人為因素的影響;

(2)細胞用量少,檢測靈敏度高,穩定;

(3)可反復用酶標儀讀板,檢測時間靈活,不影響細胞進行后續實驗;

(4)CCK-8產生的Formazan是水溶性的,無需換液,尤其適用于懸浮細胞,與MTT法相比更方便,更安全。

目的:考察目的基因對細胞的增殖能力產生的影響或藥物對細胞增殖能力的影響

材料:目的細胞、穩轉株(空載、目的基因)

步驟:

細胞收集——細胞鋪板——(藥物處理)——細胞培養0、6、24、48、72小時后加入CCK-8處理,酶標儀檢測

結果:

實驗原理(CellTiter-Glo?)

        ATP腺嘌呤核苷三磷酸(簡稱三磷酸腺苷)參與生物體內多種酶促反應,是活細胞新陳代謝的一個指標,其含量直接反應了細胞的數量及細胞狀態:實驗過程中向細胞培養基加入等體積CellTiter-Glo?試劑,測量發光值,在光信號和體系中,發光值與ATP量成正比,而ATP又和活細胞數正相關,因此可通過檢測ATP含量得細胞活力。

CTG方法優勢:

(1)同普通的MTT、CCK8法相比,CellTiter-Glo?發光活細胞檢測系統的檢測試劑具有最高靈敏度和較長的信號持續時間,此系統已經廣泛地應用在生命科學研究領域中,如一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等;

(2)CellTiter-Glo?試劑和細胞培養中的常用培養基兼容,如RPMI1640、MEM、DMEM和 Ham's F12,也不受酚紅和有機溶劑的影響,誤差小,準確率高。

目的:考察目的基因對細胞的增殖能力產生的影響或藥物對細胞增殖能力的影響

材料:目的細胞

步驟:

細胞收集——細胞鋪板——(藥物處理)——細胞培養0、24、48、72、96小時后加入CellTiter-Glo?溶液用微孔板震蕩器5分鐘,于室溫放置10分鐘-酶標儀檢測熒光值

結果:

MTT   CCK8   CTG  檢測方法對比


 

2 細胞凋亡

        細胞凋亡是腫瘤和發育研究的重點,同時也是藥理學研究的熱點。細胞凋亡是指細胞在一定的生理或病理條件下,遵循自身的程序,自主結束其生命的過程。它是一個主動的,高度有序的,基因控制的,一系列酶參與的過程。細胞凋亡的過程大致可分為以下幾個階段:接受凋亡信號→凋亡調控分子間的相互作用→蛋白水解酶的活化(Caspase)→進入連續反應過程。

基本原理

    細胞凋亡檢測采用Annexin V/PI雙染法檢測,Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白,能與磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)高親和力特異性結合。在細胞凋亡的早期,PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面,暴露在細胞外環境中。將Annexin V 進行熒光素(FITC或PE)或Biotin 標記,以標記了的Annexin V 作為熒光探針,利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。

    7-AAD類似于碘化丙啶(propidine iodide,PI)是一種核酸染料,它不能透過完整的細胞膜,但在凋亡中晚期的細胞和死細胞,7-AAD能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin V 與7-AAD 匹配使用,就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。

目的: 通過慢病毒感染獲得過表達某基因的細胞株,利用Annexin-PE和7-AAD雙染法對正常細胞、對照組細胞、基因過表達組細胞的凋亡情況進行檢測,研究基因對細胞凋亡的影響。

材料:質粒與細胞株

步驟:細胞準備——收集細胞——Annexin-PE和 7-AAD進行雙染色——流式上機檢測

結果:


3 細胞侵襲和遷移

        在腫瘤發展過程中,細胞進入循環系統的能力是重要的研究對象。相關的信號通路主要可以分為控制細胞黏附和控制細胞骨架。細胞的遷移與侵襲主要與細胞骨架和黏附相關。腫瘤細胞侵襲和遷移能力的改變通常采用Transwell進行檢測。細胞劃痕也是測定腫瘤細胞運動特性的方法,由于無法區別正常增殖和遷移細胞,應用有局限性。

Transwell實驗

        Transwell小室底層的一張有通透性的膜(一般為聚碳酸酯膜),將其放置于孔板中,小室內稱上室,培養板內稱下室。由于聚碳酸酯膜有通透性,下層培養液中的成分可以影響到上室內的細胞。應用Transwell可研究下層培養液中的成分對細胞生長、運動等的影響。

        腫瘤遷移實驗:研究腫瘤細胞的遷移能力或特定情況下腫瘤細胞的遷移能力。常用8.0、12.0μm膜,上室種腫瘤細胞,下室加入FBS或某些特定的趨化因子,腫瘤細胞會向營養成分高的下室跑,計數進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的遷移能力。

        腫瘤侵襲實驗:研究腫瘤細胞的侵襲能力或特定情況下腫瘤細胞的侵襲能力。在聚碳酸酯膜上涂上一層基質膠,模仿細胞外基質,上室種腫瘤細胞,下室加入FBS或某些特定的趨化因子,細胞要把基質消化后才可以從上室遷移到下室,計數進入下室的細胞量測定細胞的侵襲能力。

目的: 研究目的基因過表達/干擾對細胞侵襲、轉移能力的影響

材料:正常細胞、對照慢病毒、過表達基因慢病毒

步驟:細胞復蘇——Transwell鋪板——細胞培養及染色——拍照

結果:


劃痕實驗原理

腫瘤細胞在體外仍具有遷移的能力。細胞劃痕法是測定了腫瘤細胞的運動特性的方法之一。其借鑒體外細胞致傷愈合實驗模型,在體外培養的單層細胞上,劃痕致傷,然后比較不同實驗組中腫瘤細胞遷移的能力。

目的: 使用篩選的穩定株(轉對照病毒、過表達基因病毒),通過對空細胞、對照穩轉、目的基因穩轉三組細胞進行劃痕寬度進行統計學分析,研究基因對細胞遷移能力的影響。

材料:病毒和細胞株,目的細胞來源于客戶,穩定株和元構建

步驟:細胞鋪板——劃線——細胞培養及拍照——統計分析

結果:



4 細胞周期檢測

        細胞周期(cell cycle)是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程,分為間期與分裂期兩個階段。細胞周期反應了細胞增殖速度,單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法,但它不能代表細胞群體的周期,故現多采用其他方法測群體周期。

基本原理:

    細胞周期各時相的DNA含量不同,通常正常細胞的 G0/G1期具有二倍體細胞的DNA 含量(2N),而G2/M期具有四倍體細胞的DNA含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。PI 即碘化丙錠,可以與細胞內DNA 和RNA 結合,采用RNA酶將RNA消化后,通過流式細胞術檢測到的與DNA 結合的PI 的熒光強度直接反映了細胞內DNA含量的多少。

因此,通過流式細胞術PI染色法對細胞內DNA含量進行檢測時,可以將細胞周期各時相區分為 G0/G1期,S 期和G2/M期,并可通過特殊軟件計算各時相的百分率。

目的: 通過慢病毒感染獲得基因過表達的細胞株,利用PI染色法結合流式細胞術檢測各組細胞周期的變化。從而研究目的基因對細胞周期的影響。

材料:目的細胞、病毒

步驟:細胞準備——樣品收集——上機檢測——數據分析

結果:



5.克隆形成實驗

基本原理:

        單個細胞在體外增殖6代以上(時間約1周以上),其后代所形成的細胞群體,稱為集落或克隆。每個克隆含有50個以上的細胞,大小在0.3 - 1.0mm之間。細胞接種存活率只表示接種細胞后貼壁的細胞數, 但貼壁后的細胞不一定每個都能增殖并形成克隆。只有同時具有貼壁和增殖活力的細胞才會形成克隆。克隆形成率反映細胞的獨立生存能力的強弱,用于評價細胞群體依賴性和增殖能力。由于細胞生物學性狀不同,細胞克隆形成率差別也很大,一般初代培養細胞克隆形成率弱,傳代細胞系強; 二倍體細胞克隆形成率弱,轉化細胞系強;正常細胞克隆形成率弱,腫瘤細胞強。    

        克隆形成率與接種密度有一定關系,做克隆形成率測定時,接種細胞一定要分散成單細胞懸液,直接接種在培養皿中,持續一周以上,隨時檢查,到細胞形成克隆時終止培養。

目的:通過目的基因過表達/干擾細胞組、空細胞組與陰性對照組(空病毒)克隆形成數量的統計學分析,研究基因對細胞群體依賴性和增殖能力的影響。

材料:病毒和細胞株

步驟:鋪板——細胞培養——觀察克隆,染色,計算克隆形成率

結果:





細胞株現貨

        和元上海擁有豐富的細胞現貨庫,以腫瘤細胞株為主要特色的細胞庫,涵蓋幾百種現貨腫瘤細胞株。同時還有已經構建過表達熒光、抗性或攜帶Luc的穩定細胞株客供選擇, 細胞庫管理專業、規范,技術團隊是專業從事細胞培養、保種、鑒定和檢測的團隊。

 




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