首頁

下游實驗

ncRNA研究及實驗服務

       ncRNA研究及實驗服務


非編碼RNANon-coding RNA)是指不編碼蛋白質的RNA,包括miRNAlncRNAcircRNApiRNA等。非編碼RNA發揮功能的方式很多,可以與蛋白、DNARNA相互作用,參與多種細胞活動,主要包括基因的激活和沉默,RNA的剪接、修飾和編輯,蛋白質的翻譯等。


1.miRNA

        miRNA是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子,它們在動植物中參與轉錄后基因表達調控。每個miRNA可以有多個靶基因,而幾個miRNA也可以調節同一個基因。


圖一 miRNA成熟及作用方式(Mikhailidis DP, Athyros VG. Nat Rev Cardiol. 2014 Feb;11(2):72-4.

miRNA過表達:miRNA前體序列構建入病毒載體中,該載體既可用于瞬時轉染細胞,也可以包裝成病毒用于穩定株篩選和動物水平過表達miRNA

miRNA敲低:設計針對miRNATuD RNA封閉片段或海綿片段,再將該片段構建入病毒載體中。該載體除了可以直接瞬時轉染細胞用于miRNA的敲低,也可以包裝成慢病毒,用于動物水平敲低miRNA

miRNA靶基因預測:miRNA通過堿基互補配對的方式識別靶基因的3UTR區,并根據互補程度的不同指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。因此,可以將目的基因的3UTR區域構建到含luciferase的報告基因上,通過比較miRNA過表達或inhibitor 與報告基因作用檢測熒光值的變化,判斷miRNA對靶基因的作用。再通過對3UTR區進行定點突變的方法進一步確定miRNA與靶基因3UTR的作用位點。


miRNA常用數據庫:

miRbasehttp://www.mirbase.org):miRbase 是由曼徹斯特大學的研究人員開發的一個在線的miRNA數據庫,提供包括已發表的miRNA序列數據、注釋、預測基因靶標等信息的全方位數據庫,是存儲miRNA信息最主要的公共數據庫之一。

TargetScanhttp://www.targetscan.org/):TargetScan是通過搜索和每條miRNA種子區域匹配的保守的8mer7mer位點來預測靶基因。

TarBasehttp://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.php?r=tarbasev8%2Findex):TarBase數據庫人工經歷了長達10年左右的時間去搜集了實驗驗證過的miRNA的靶基因,包括在人、小鼠、果蠅、蠕蟲和斑馬魚中的miRNA的靶基因。

miRWalkhttp://www.ma.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/):miRWalkis是一個綜合性數據庫,提供來自人類、小鼠和大鼠的miRNA的預測信息和經過驗證的位于其靶基因上的結位點。


2.lncRNA

        lncRNA是長鏈非編碼RNAlong non-coding RNA)的簡稱,是長度在200-100000 nt之間的RNA分子。大多數的lncRNAs在組織分化發育過程中,都具有明顯的時空表達特異性;序列上保守性較低,只有約12%lncRNA可在人類之外的其它生物中找到。

        根據lncRNA在基因組上相對于蛋白編碼基因的位置,可以將其分為啟動子區(promoter associated)、內含子間(intronic)、雙向(bidirectional)、正義鏈(sense)、反義鏈(antisense)、3’UTR區(3’UTR associated)、基因間(intergenic)這7種類型。這種位置關系對于推測lncRNA的功能有很大幫助。


圖二 lncRNA分類(Huang X, et al.Cancer Lett. 2018 Jan 28;413:94-101.

一般來說,lncRNA主要從以下三種層面實現對基因表達的調控:

表觀遺傳學調控:lncRNA招募染色質重構復合體到特定位點進而介導相關基因的表達沉默。

轉錄調控:包括如下幾種:1lncRNA的轉錄能夠干擾臨近基因的表達;2lncRNA能夠通過封阻啟動子區域來干擾基因的表達;3lncRNA能夠與RNA結合蛋白作用,并將其定位到基因啟動子區從而調控基因的表達;4lncRNA能夠調節轉錄因子的活性;5lncRNA也能夠通過調節基本轉錄因子來實現調控基因的表達。

轉錄后調控:lncRNA能夠在轉錄后水平通過與mRNA形成雙鏈的形式調控基因的表達。

lncRNA過表達:lncRNA序列構建入病毒載體中,該載體既可用于瞬時轉染細胞,也可以包裝成病毒用于穩定株篩選和動物水平過表達lncRNA

lncRNA干擾:針對lncRNA設計干擾片段,再將該片段構建入病毒載體中。該載體除了可以直接瞬時轉染細胞用于lncRNA的干擾,也可以包裝成慢病毒,用于動物水平干擾lncRNA

lncRNA敲除:CRISPR/Cas9技術對lncRNA進行敲除。針對lncRNA某條片段的兩端分別設計多條sgRNA序列,實現大片段刪除,從而達到敲除的效果。將sgRNA序列構建入病毒載體中,再將Cas9序列裝入另一載體中,隨后兩種病毒同時感染目的細胞進行敲除。

lncRNA靶基因尋找:方法基本類似于上面表述的miRNA雙熒光素酶檢測。


3.circRNA

        circRNA即環形RNAcircular RNA)的簡稱,是一類不具有5’末端帽子和3’ 末端polyA)尾巴、并以共價鍵形成環形結構的客觀存在于生物體內的非編碼RNA分子。

circRNA主要特征:

circRNA由特殊可變剪切產生,大量存在與真核細胞的細胞質中,主要來源于外顯子,少部分內含子來源的circRNA存在細胞核中。

表達水平具有種屬、組織、時間特異性。

circRNA呈閉合環狀結構,不易被核酸外切酶降解,比線性RNA更加穩定。

具有一定序列保守性。

在轉錄或轉錄后水平發揮調控作用。

絕大多數circRNA是非編碼的,但也有少數可以翻譯為多肽。


        circRNA根據其來源可分為三類:外顯子來源的circRNAexonic circRNAs),內含子來源的circRNAcircular intronic RNAsciRNAs),以及由外顯子和內含子共同組成的circRNAretained-intron circRNAs)。

circRNA的作用機制:

miRNA分子海綿,circRNA含有大量的miRNA結合位點,具有miRNA海綿作用,進而間接調控miRNA下游靶基因的表達。

調控基因轉錄,circRNA也可以通過與RNA結合蛋白的結合來調控蛋白功能,比如通過與轉錄因子的結合來抑制基因的轉錄。

編碼功能,circRNA雖然屬于非編碼RNA,但是也有少數circRNA可以編碼多肽,通過該多肽行使調控功能

miRNA海綿機制(圖片來自網絡)



circRNA過表達:同上述的lncRNA步驟類似,但是circRNA過表達由于成環效率的影響,其難度相對普通基因的過表達更大。

circRNA干擾:同上述的lncRNA方法步驟。

circRNA敲除:同上述的lncRNA方法步驟。

circRNA靶基因尋找:同上述的miRNAlncRNA雙熒光素酶檢測方法。


我們的優勢:

項目經驗豐富,成功率高;

價格優惠,享受折扣;

實驗周期短;

完善的售后服務。 
 

杭州聯川生物技術股份有限公司. All Rights Reserved.
浙ICP備15020535號
pk10手机开奖视频